fa بیوتکنولوژی انتقال ژن در ماهی زبرا به عنوان مدل تحقیقاتی انتقال ژن در آبزیان پرورشی تخصصي Special پژوهشي Research <span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;">جهت ایجاد ماهی رنگی زینتی زبرا، واکنش زنجیره&shy;ای پلیمراز (</span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">PCR</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;">) با استفاده از آغازگرهای طراحی شده برای پیشبر دو ژن انتخاب شده در سلول&shy;های عضلاتی و همسانه&shy;سازی این قطعات ژنی در وکتور </span></span><em><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">Tol2</span></span></span></span></em><span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;"> که خود حاوی ژن پروتئین فلوئورسنت سبز (</span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">GFP</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;">) بود در ناحیه خوانش باز (</span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">ORF</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;">) صورت گرفت. به ترتیب قطعات 2000 و 2300 جفت بازیِ ناحیه پیشبر ژن&shy;های </span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">MYLZ2</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;"> و </span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">CKMB</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;"> بوسیله واکنش زنجیره&shy;ای پلیمراز تکثیر شده، در وکتور بیانی </span></span><em><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">Tol2</span></span></span></em> <span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;">دارای جایگاه برشی آنزیم </span></span><em><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">SalI</span></span></span></span></em> <span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;">همسانه&shy;سازی شد و به باکتری اشریشیاکلی (</span></span><em><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">E</span></span></span></em><em><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">. coli</span></span></span></span></em><span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;">) سویه </span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">Dh5&alpha;</span></span></span></span> <span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;">انتقال یافت. همسانه&shy;های مثبت توسط </span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">colony</span></span></span></span> <span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">PCR</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;"> با استفاده از آغازگرها مورد بررسی قرار گرفت و برای استخراج پلاسمید نوترکیب کشت شد. پلاسمید نوترکیب استخراج شده توسط هضم آنزیمی </span></span><em><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">SalI</span></span></span></span></em> <span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;">بررسی شد و به کمک آغازگرهای عمومی تعیین توالی گردیدند. در این مطالعه، به ترتیب قطعات 2000 و 2300 جفت بازیِ راه انداز ژن&shy;های </span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">MYLZ2</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;"> و </span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">CKMB</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;"> در وکتور بیانی </span></span><em><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;">Tol2</span></span></span></em> <span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;">همسانه&shy;سازی شدند که تایید آن با استفاده از واکنش زنجیره&shy;ای پلیمراز، توالی&shy;یابی و هضم آنزیمی صورت گرفت. همچنین، پلاسمید نوترکیب کشت داده شد و برای تزریق به همراه یک رونوشت سنتتیک خالص&shy;سازی گردید. جنین&shy;های تک سلولی تزریق شده (توسط پلاسمید نوترکیب و رونوشت) به وسیله میکروسکوپ فلوئورسنس برای بررسی بیان </span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">GFP</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;"> آزمایش شدند و مشخص شد که بیان </span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">GFP</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;"> در سلول&shy;های عضلانی برخی از نتاج نسل </span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">F₀</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;"> روی داده است. پلاسمیدهای نوترکیب شده با استفاده از پیشبرهای مختص سلول&shy;های عضلانی (</span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">MYLZ2</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;"> و </span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">CKMB</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;">) قادر به القاء بیان </span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">GFP</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;"> در برخی از جنین&shy;های نسل </span></span><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-family:Times New Roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">F₀</span></span></span></span><span style="color:black;"><span style="font-family:B Zar;"> به صورت موقت بودند و از این رو می توانند جهت تثبیت بیان در نسل&shy;های بعدی ماهی استفاده شوند.</span></span> <pre> The polymerase chain reaction (PCR) was applied to create the colored transgenic ornamental zebrafish with the specific primers designed for muscle promoter of two genes and genes fragments cloned in <em>Tol2</em> vector containing GFP gene in the ORF region. The 2000 bp and 2300 bp fragments of MYLZ2 and CKMB promoters&#39; genes respectively were amplified by PCR, cloned into<em> Tol2</em> plasmid expression vector containing <em>SalI</em> restriction enzyme site and transformed into <em>E. coli </em>Dh5&alpha;. Positive clones were tested for having fragments by colony PCR with anchor primers and subcultured for extracting recombinant plasmid miniprep. The extracted recombinant plasmid was tested with <em>SalI</em> enzyme digestion and sequenced with universal primers. Positive recombinant plasmids were applied for injection with transcript produced synthetically in the lab into zebrafish one-cell embryo. In this study, 2000 bp and 2300 bp fragments of MYLZ2 and CKMB promoters, respectively, were cloned in an expression vector <em>Tol2</em> and confirmed by PCR, sequencing and enzymatic digestion. Also, recombinant plasmid was subcultured and purified for injection with a synthetic transcript. One-cell embryos injected by coinjection materials (recombinant plasmid and transcript) were tested by fluorescence microscope for positive GFP expression, where a few offspring of F₀ generation were positive for GFP expression in their muscles. Recombinant plasmids with muscle-specific promoters (MYLZ2 and CKMB) were able to induce expression of GFP in some F₀ embryos in a transient form and could be applied for consolidation in the next fish generation.&nbsp; </pre> همسانه‌سازی, ماهی زبرا تراریخت رنگی, وکتور Tol2 نوترکیب, رونوشت cloning, transgenic colorful zebra fish, recombinant Tol2 vector, transcript 47 55 http://aqudev.lahijan.iau.ir/browse.php?a_code=A-10-497-1&slc_lang=fa&sid=1 ُShirin Jamshidi شیرین جمشیدی jamshidi99@yahoo.com 10031947532846008166 10031947532846008166 Yes International Sturgeon Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Rasht, Iran انستیتو تحقیقات بین الملی ماهیان خاویاری Ashkan Banan اشکان بنان banan.a@lu.ac.ir 10031947532846008167 10031947532846008167 No Department of Fisheries and Environmental Sciences, Lorestan University, Khorramabad, Iran دانشگاه لرستان